冰冻切片免疫组化抗原抗体结合检测蛋白-上海郑核
一、实验器材及试剂
1、实验器材
名称 厂家 型号
冰冻切片机 Thermo Cryotome E
载玻片 Servicebio
盖玻片 江苏世泰实验器材有限公司 C
微波炉 格兰仕微波炉电器有限公司 P70D20TL-P4
脱色摇床 Servicebio TSY-B
涡旋混合器 Servicebio MX-F
掌上离心机 Servicebio D1008E
移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573
组化笔 Gene tech GT1001
冰箱 青岛海尔股份有限公司 BCD-192TGN
显微镜 CIC XSP-C204
2、主要实验试剂
试剂 厂家 货号 稀释比
OCT包埋剂 Sakura 4583
无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司
二甲苯 国药集团化学试剂有限公司
EDTA（PH8.0)抗原修复液 Servicebio G1206
EDTA(PH9.0)抗原修复液 Servicebio G1203
柠檬酸（PH6.0)抗原修复液 Servicebio G1202
PBS缓冲液 Servicebio G0002
4%多聚甲醛 Servicebio G1101
3%双氧水 Servicebio G0115
BSA Servicebio G5001
正常兔血清 Servicebio G1209
苏木素染液 Servicebio G1004
苏木素分化液 Servicebio G1309
苏木素返蓝液 Servicebio G1340
中性树胶 Servicebio G1403
一抗：
二抗：
组化试剂盒DAB显色剂 Servicebio G1211
二、冰冻切片免疫组化实验步骤
1、冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，置于4%多聚甲醛固定10min，于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中低火10-15min，断电间隔10min转至中低火10-15min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）
3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗是山羊来源用10%正常兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）
5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。
7、DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
8、复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
9、脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min --无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
10、显微镜镜检，图像采集分析。
三、冰冻切片免疫组化实验结果判读
苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。
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